蛋白质浓度测定常用比色法。其中，BCA法和Bradford法定量是最常用的蛋白浓度测定方法。每种蛋白质定量方法都有其局限性，在选择蛋白质定量方法时，最需要考虑的特性是灵敏度、与样品中常见物质的相容性(如洗涤剂、还原剂、抑制剂、盐和缓冲液)、标准曲线线性和蛋白质之间的差异等。
蛋白定量BCA法和Bradford法对比
| |
BCA法 |
Bradford法 |
| 测定范围 |
20–2000 µg/mL |
100-1500 µg/mL |
| 检测原理 |
在碱性的条件下，蛋白质将碱性Cu(II)还原为Cu(I)。两分子的二辛可宁酸（BCA）螯合一个Cu(I)，形成紫色的反应复合物。该复合物的水溶液在562nm处显示强烈的吸光性 |
在试剂的酸性环境中，蛋白能与考马斯染料结合。这导致染料的最大吸收发生位移，从红棕色形式转化为蓝色形式。蛋白-染料结合物在595nm波长下吸收最大 |
| 优点 |
兼容大多数去垢剂 |
蛋白定量方法中，测定最快速，方法最简单，且在室温下进行 |
| 蛋白质间差异性小于Bradford法 |
与大多数盐离子、溶剂、缓冲剂、硫醇、还原性物质和金属螯合剂兼容 |
| 缺点 |
能还原铜离子的物质也能造成显色，影响定量的准确性 |
与通常用于溶解膜蛋白的高浓度去垢剂不兼容 |
| 与铜离子螯合的试剂，DTT 等常见还原剂和特定的单个氨基酸也会在BCA检测中显色（半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸） |
与BCA法相比，蛋白质之间的差异性较大 |
| 需要孵育温度以及时间的消耗 |
- |
BCA法
试剂配制：
1、BCA试剂
A） 试剂A：分别称取1%(w/v)BCA ，2%(w/v)Na2CO3·H2O，0.16%(w/v)Na2C4H4O6·2H2O，0.4%(w/v)NaOH，0.95%(w/v)NaHCO3，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。
B）试剂B：4%(w/v)CuSO4·5H2O。
C）BCA试剂：试剂A:试剂B=50:1,混合均匀。
2、牛血清蛋白标准（BSA）标准蛋白质母液：配制成5mg/ml的BSA标准溶液（配制溶液需与待测样品溶液保持一致）。
实验操作：
1、配制标准曲线待测样品：用标液配置溶液稀释BSA母液10倍，至浓度为0.5mg/ml。取96孔酶标板，按下表加入试剂
| 序号 |
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
| 0.5mg/mlBSA溶液（μl） |
0
|
1
|
2
|
4
|
8
|
12
|
16
|
20
|
| 标液配置溶液（μl） |
20
|
19
|
18
|
16
|
12
|
8
|
4
|
0
|
| 蛋白质浓度（mg/ml） |
0
|
0.025
|
0.05
|
0.1
|
0.2
|
0.3
|
0.4
|
0.5
|
每份标样分别加入BCA试剂200μl。
2、配制待测样品：准确吸取20μl样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μl。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度标曲浓度范围内。
3、样品处理：轻摇，于37℃保温30-60min，冷却至室温。
4、测定：以空白为对照，在酶标仪上562nm处比色，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。
BCA法试剂
| 产品号 |
名称 |
级别 |
Cas |
规格 |
| B107658 |
2,2'-联喹啉-4,4'-二甲酸二钠(BCA) |
98% |
979-88-4 |
1g,5g,25g |
| S113834 |
碳酸钠，一水 |
ACS |
5968-11-6 |
1g,50g,250g |
| S111691 |
酒石酸钠二元二水合物 |
AR, ≥99% |
6106-24-7 |
100g,500g |
| S111518 |
氢氧化钠 |
AR,96%,颗粒状 |
1310-73-2 |
500g,12*500g,20*500g |
| S112331 |
碳酸氢钠 |
AR,≥99.8% |
144-55-8 |
500g,12*500g,20*500g,10Kg |
| C112396 |
硫酸铜，五水 |
AR,99% |
7758-99-8 |
500g,20*500g |
| A119741 |
牛血清白蛋白含量标准物质 |
98% |
9048-46-8 |
200mg |
Bradford法
试剂配制：
1、染色剂：0.01％考马斯亮蓝G250,8.5%磷酸和4.75%乙醇。
2、牛血清蛋白标准（BSA）标准蛋白质母液：配制成10mg/ml的BSA标准溶液（配制溶液需与待测样品溶液保持一致）。
实验操作：
1、配制标准曲线待测样品：
A）在BSA母液中加入标液配置溶液，配置一组浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的BSA溶液。
| 序号 |
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
| 10mg/mlBSA母液（μl） |
0
|
20
|
40
|
60
|
80
|
100
|
| 标液配置溶液（μl） |
1000
|
980
|
960
|
940
|
920
|
900
|
| 蛋白质浓度（mg/ml） |
0
|
0.2
|
0.4
|
0.6
|
0.8
|
1
|
B）对于上述配制好的BSA溶液，再用P标液配置溶液分别稀释10倍。
| 序号 |
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
| 步骤A配置完成的BSA溶液（μl） |
100
|
100
|
100
|
100
|
100
|
100
|
| 标液配置溶液（μl） |
900
|
900
|
900
|
900
|
900
|
900
|
| 蛋白质浓度（mg/ml） |
0
|
0.02
|
0.04
|
0.06
|
0.08
|
0.1
|
C）分别移取50μl步骤B中配制好的一组待测标准BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200μl考马斯亮蓝G250。静置10min后检测。
2、配制待测样品：准确吸取50μl样品溶液于孔板中，加入考马斯亮蓝G250试剂200μl。静置10min后检测。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度在0.1-1.0mg/ml。
3、用酶标仪在595nm波长下测定溶液的吸光度。以BSA含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。
Bradford法试剂
| 产品号 |
名称 |
级别 |
Cas |
规格 |
| B104237 |
考马斯亮蓝G250 |
AR |
6104-58-1 |
5g,10g,25g,100g,200g |
| P112024 |
磷酸 |
AR, ≥85 wt. % in H2O |
7664-38-2 |
500ml,12*500ml,2.5L |
| A112717 |
乙醇(95%) |
AR,95.0% |
64-17-5 |
500ml,12*500ml,20*500ml,4*5L,10L,25L |
| P196987 |
PBS缓冲液 |
1× |
- |
500ml |
| P196986 |
PBS缓冲液 |
10× |
- |
100ml,500ml,1L |
| A119741 |
牛血清白蛋白含量标准物质 |
98% |
9048-46-8 |
200mg |